L’Orto botanico dell'Università di Padova fu istituito nel 1545 per la coltivazione delle piante medicinali, che allora costituivano la grande maggioranza dei "semplici", cioè di quei medicamenti che provenivano direttamente dalla natura. Proprio per questa ragione i primi orti botanici vennero denominati “giardini dei semplici” ovvero horti simplicium.

In quel tempo era già consolidata la fama dell’Ateneo padovano nello studio delle piante, soprattutto come applicazioni della scienza medica e farmacologica: qui infatti venivano lette e commentate le opere botaniche di Aristotele e di Tefrasto; sempre qui tra gli altri avevano studiato Alberto Magno di Laningen (1193-1280), considerato il più grande cultore della materia dopo Aristotele, e Pietro D’Abano (1253-1316), che aveva tradotto in latino la terapeutica greca di Galeno.

Nell’epoca in cui l’Orto fu fondato regnava grande incertezza circa l'identificazione delle piante usate in terapia dai celebri medici dell'antichità: frequenti erano gli errori e anche le frodi, con grave danno per la salute pubblica. L'istituzione di un horto medicinale, sollecitata da Francesco Bonafede che allora ricopriva la cattedra di "lettura dei semplici", avrebbe permesso agli studenti un più facile riconoscimento delle vere piante medicinali dalle sofisticazioni. Per questo scopo il primo "custode" dell'Orto, Luigi Squalermo detto Anguillara, vi fece introdurre e coltivare un gran numero di specie (circa 1800).

L'Orto, per la rarità dei vegetali contenuti e per il prezzo dei medicamenti da essi ricavati, era oggetto di continui furti notturni, nonostante le gravi pene previste per chi avesse arrecato danni (multe, carcere ed esilio). Venne quindi ben presto costruito un muro di recinzione circolare (da cui anche i nomi di hortus sphaericus, hortus cinctus e hortus conclusus).

L'Orto era continuamente arricchito di piante provenienti da varie parti del mondo, specialmente dai paesi dove la Repubblica di Venezia aveva possedimenti o scambi commerciali; proprio per questa ragione Padova ha avuto un posto preminente nell'introduzione e nello studio di molte specie esotiche.