Non esistono documenti che attestino la paternità del progetto dell'Horto medicinale, anche se è documentato il coinvolgimento nei lavori di esecuzione dell'architetto bergamasco Andrea Moroni, autore anche del cortile antico di Palazzo Bo. La forma trapezoidale del terreno a disposizione, che precedentemente apparteneva al vicino monastero di Santa Giustina, condizionò la pianta dell'Orto; allo stesso tempo su di essa influirono anche le concezioni scientifiche e filosofiche del tempo, dando luogo a una rappresentazione densa di significati geografici, astrologici e forse persino esoterici, presumibilmente con il contributo determinante di Daniele Barbaro, umanista, scienziato e successivamente cardinale della Chiesa cattolica.

Fu creata una struttura circolare con un quadrato inscritto, a sua volta suddiviso in quattro quadrati più piccoli da due viali perpendicolari. I quattro "quarti", detti anche "spalti" perché originariamente sopraelevati di circa 70 cm rispetto ai viali, erano suddivisi in aiuole ("areole") disposte in modo da formare eleganti disegni geometrici, diversi uno dall'altro. Pochi anni dopo la fondazione, nel 1552, fu costruito un muro circolare di recinzione, per impedire i continui furti notturni delle preziose piante medicinali.

La struttura architettonica dell'Orto subì in tempi successivi modifiche e arricchimenti, che però non alterarono in modo sostanziale il disegno originario. All'inizio del Settecento vennero realizzati i quattro monumentali portali d'ingresso dell'Hortus cinctus, con stipiti in trachite sormontati da vasi in pietra (acroteri) contenenti piante in ferro battuto e provvisti di eleganti cancelli, anch'essi in ferro battuto. Venne eliminato il dislivello tra i viali e gli "spalti" e modificato il disegno delle aiuole; furono inserite delle fontane al centro di ciascun quarto, alle quali se ne aggiungeva una all'incrocio dei due viali principali. Il muro circolare fu ingentilito, nella prima metà del Settecento, da una balaustra con eleganti colonnine in pietra bianca, su cui furono collocati vasi e busti di importanti personaggi, rivolti verso il centro dell'Orto.

In tempi successivi, l'Orto si estese fino ad occupare anche l'area esterna al muro circolare, dove vennero realizzate altre fontane: la fontana di Teofrasto, detta così poiché vi fu collocata una statua del filosofo greco del III secolo a.C., considerato il padre della botanica (porta sud), e quella detta delle Quattro Stagioni (porta est) per la presenza, oltre a una statua di Salomone firmata dallo scultore padovano Giovanni Bonazza, dei busti marmorei settecenteschi raffiguranti le Quattro Stagioni.

Nella prima metà dell'Ottocento furono inserite tre meridiane: una cubica, una sferica e una cilindrica. Vennero anche realizzate serre in muratura, in sostituzione delle "conserve" mobili utilizzate in precedenza; una di queste serre ottocentesche conserva ancora l'originale struttura interna con eleganti archi e colonnine in ghisa. Fu costruita un'aula ad emiciclo della capienza di cento studenti, detta "teatro botanico", tuttora in uso per lezioni e riunioni.

Sul cornicione del "teatro botanico" furono collocati i busti di eminenti studiosi: al centro quello di Francesco Bonafede, promotore dell'istituzione dell'Horto medicinale, assieme a quelli di Giuseppe Pitton de Tournefort, Carlo Linneo, Antonio Bernardo de Jussieu e Marcello Malpighi. Il grande edificio in prossimità dell'ingresso, che risale ai secoli XVII e XVIII, era un tempo destinato ad abitazione del Direttore dell'Orto (tradizionalmente denominato Prefetto).